Wibracje wzmacniają zainicjowane środowiskiem przemiany komórek macierzystych szpiku kostnego w adipocyty

Naukowcy z Uniwersytetu Sichuan (Chiny) badali wpływ wibracji na różnicowanie (dojrzewanie) komórek macierzystych szpiku kostnego (KMSK). KMSK mogą stać się prekursorami różnych rodzajów komórek, w tym tkanki kostnej czy tłuszczowej, które w szpiku kostnym muszą występować w równowadze. Za dużo np. tkanki tłuszczowej może sprzyjać rozwojowi osteoporozy. Jakkolwiek wcześniejsze badania pokazały, że wibracje pozytywnie wpływają na pobudzanie osteogenezy (kostnienia), co wykorzystuje się w terapii osteoporozy, to niewiele wiadomo o ich wpływie na formowanie komórek tkanki tłuszczowej (adipocytów), czyli na adipogenezę, choć istnieją doniesienia o hamowaniu tego procesu przy jednoczesnym promowaniu osteogenezy. Jednak autorzy opracowywanej publikacji wykazali in vitro, że w sprzyjającym adipogenezie (adipogennym) medium zastosowane wibracje (15 min/ dzień) znacząco nasilały proces formowania komórek tłuszczowych. Zasugerowali zatem konieczność zrewidowania parametrów wibracji używanych w leczeniu osteoporozy. Wibroterapia^Pro w „Podsumowaniu” zwraca uwagę na niepełne prawo do takiego wnioskowania, jak również na dodatkowe ciekawe wnioski mogące wynikać z przedstawianych badań.

W omawianej pracy określano wpływ wibracji na proces różnicowania KMSK hodowanych w środowisku adipogennym. Ponieważ wyników badań in vitro nie można przekładać wprost na wnioski in vivo, miało to służyć sprawdzeniu, czy choćby teoretycznie wibracje stosowane w leczeniu osteoporozy, oprócz obserwowanego przez wielu autorów działania osteogennego (kostnotwórczego) – pożądanego w leczeniu tej choroby, mogą nasilać niepożądaną w tym przypadku adipogenezę.

• Wibracje o 18% zwiększały liczbę komórek magazynujących tłuszcz, a zatem genezę i dojrzewanie adipocytów.
• Wibracje stymulowały KMSK do zwiększonej ekspresji genów kodujących białka niezbędne w adipogenezie (jak PPARγ); wzrost dochodził nawet do ok. 170%.
• Po zastosowaniu wibracji poziom aktywnej formy sygnałowego białka p38 ulegał średnio ok. 3-krotnemu podwyższeniu.
• Zablokowanie p38 zmniejszało adipogenezę wyrażaną poziomem białka PPARγ lub formowaniem kropelek tłuszczu, tak w grupie kontrolnej, jak i poddanej wibracjom.

Opracowan0 na podstawie:

Badana populacja

Kultura pierwotna komórek macierzystych szczura

Badania prowadzono na kulturze komórkowej wyprowadzonej z komórek macierzystych szpiku kości piszczelowej i udowej 3-tygodniowych szczurów płci męskiej, rasy Sprague–Dawley. Komórki hodowano w medium o składzie: DMEM (Gibco, Grand Island, Nowy Jork, USA), 10% FBS (Gibco) i 1% penicylina-streptawidyna. Stosowano temperaturę 37°C i 5% CO₂. Hodowlę KMSK doprowadzono do 100% konfluentności i dopiero wtedy zaangażowano w eksperyment.

Jako grupę kontrolną użyto KMSK w medium indukującym różnicowanie komórek macierzystych w adipocyty (adipogennym) bez wibracji. Jako grupa badana (wibracyjna) posłużyły KMSK hodowane jak wyżej, ale dodatkowo stosowano wibracje.

Indukcja adipogenna

Użyto OriCell™ SD Rat Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium (Cyagen Biosciences, Guangzhou, Chiny). KMSK przeniesiono do medium adipogennego skomponowanego najpierw w wersji A (1µl/ml deksametazonu, 1µl/ml rosiglitazonu i 1µl/ml izobutylometyloksantyny oraz 2µl/ml insuliny), zagęszczenie komórek wynosiło 10⁶/ml. Po 72 h, medium A zastąpiono na kolejne 24 h medium adipogennym w wersji B (2µl/ml insuliny). Stosowano 1 do 3 takich 96-godzinnych cykli.

Procedura badania

Badanie procesu różnicowania w adipocyty – barwienie Oil Red O

Komórki indukowano do dojrzewania w adipocyty przez 8 dni, następnie wysiano je na 6-cio dołkowe płytki (10⁶/ml). Po adherencji komórki utrwalano w 10% paraformaldehydzie przez 20 min, płukano w PBS i barwiono roztworem Oil Red O (Cyagen Biosciences) przez 20 min, nasączano 60% izopropanolem i płukano w PBS. Zdjęcia wykonano mikroskopem jasnego pola (Olympus, Tokio, Japonia) i analizowano programem Image J (National Institute of Health, Maryland, USA).

Badanie ekspresji genów adipogennych – Ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym

Całkowite RNA wyekstrahowano z próbek w 1, 4, 8 lub 14 dniu, dodając kolejno 1ml trizolu (TAKARA Biotechnology, Dalian, Chiny), 200 μl chloroformu oraz 500 μl izopropanolu. Oznaczano stosunek wartości absorbancji 260/280, by potwierdzić czystość całkowitego RNA. Syntezy cDNA dokonano stosując PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Biotechnology – lista starterów w tab. 1 pracy oryginalnej). Reakcje amplifikacji prowadzono przy pomocy ABI PRI SM 7300 Sequence Detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Stosowano SYBR Premix Ex Taq™II(TliRNaseH Plus) Kit (Takara Biotechnology). Reakcję ustawiono na 3 kroki: i) denaturacja (95 ˚C, 30 s), ii) hybrydyzacja starterów [annealing; (autorzy podają temperaturę 95 ˚C, jednak jest to najprawdopodobniej „literówka”, gdyż do przyłączania starterów stosuje się temperaturę niższą, odpowiednią dla danych starterów, zazwyczaj do 60 ˚C), 5 s] oraz iii) elongacja (amplifikacja genu; 60 ˚C, 31 s). Specyficzność produktów PCR oceniano analizując krzywą topnienia. Do normalizacji względnych wartości ekspresji genów użyto genu metabolizmu podstawowego: GAPDH.

Badanie poziomu białka PPARγ oraz aktywnej i nieaktywnej formy białka p38 – Western Blot

Mierzono poziom białek PPARγ, p38 oraz fosfo-p38 prezentowany przez KMSK w różnych warunkach hodowlanych. Białka uwalniano z komórek za pomocą Whole Cell Lysis Assay Kit (Keygen, Nanjing, Chiny). Komórki płukano w zimnym PBS, po czym dodawano 1 ml buforu do lizy, mocno wytrząsano (4 s, 4 ˚C) i pozostawiano na lodzie (4 min). Całą procedurę powtarzano 5-krotnie. Otrzymane lizaty komórkowe wirowano (12000 g, 5 min, 4 ˚C), do dalszych etapów zbierano supernatant, gdzie mierzono całkowite stężenie białka, stosując BCA Protein Assay Kit (Keygen). Następnie białka rozdzielano na żelu (10% SDS-PAGE) i transferowano na membrany PVDF (Millipore, USA), na których dokonywano detekcji badanych białek za pomocą odpowiednich przeciwciał poliklonalnych (królicze; Abcam, Cambridge, UK; przez noc, 4˚C). Następnie tak powstałe immunobloty inkubowano z odpowiednim przeciwciałem 2-rzędowym (Abcam; 1 h, temp. pok.). PPARγ, p38 lub fosfo-p38 wizualizowano odpowiednimi reagentami do chemiluminescencji (Millipore). Poziom chemiluminescencji analizowano programem Image J (National Institute of Health).

Badanie udziału p38 w adipogenezie – podanie SB203580

Aby potwierdzić zaangażowanie p38 w adipogenezę KMSK, stosowano SB203580 (Byotime, Szanghaj, Chiny), wysoce selektywny inhibitor p38. W grupie wibracyjnej stworzono podgrupy: grupę wibracyjną + inhibitor lub grupę wibracyjną + DMSO (rozpuszczalnik dla inhibitora; Sigma). W grupie wibracyjnej + inhibitor na 2 h przed ekspozycją na wibracje KMSK umieszczano w adipogennym medium z dodatkiem 10 µM SB203580 rozpuszczonego w DMSO. Komórki grupy wibracyjnej + DMSO traktowano identycznie, z tym że zamiast inhibitora używano jego rozpuszczalnika. Stworzono również analogicznie traktowane 2 podgrupy grupy kontrolnej: grupę kontrolną + inhibitor lub grupę kontrolną + DMSO. Różniło je jedynie to, że nie dostarczano im wibracji.

Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki wysiewano na 8-studzienkowe szkiełko mikroskopowe Millicell EZ. Po adherencji poddawano je płukaniu w PBS, następnie utrwalano w 4% paraformaldehydzie (30 min, temp. pok.) i blokowano 0,5% BSA (15 min, temp. pok.). Po inkubacji (przez noc, 4 ˚C) z przeciwciałem anty-PPARγ (1:60; Abcam) komórki inkubowano (20 min, 37 ˚C) z przeciwciałem 2-rzędowym sprzężonym z rodaminą (Hebei Bio-high Technology Deve co., Hebei, Chiny). Następnie komórki płukano w PBS i obserwowano pod fluorescencyjnym mikroskopem inwersyjnym (Olympus IX 71, Olympus). Obrazy zbierano programem Image-Pro Plus v6.0 (Media Cybernetics) i analizowano programem Image J (National Institute of Health).

Wykorzystanie wibracji w badaniu

Skonstruowano specjalne stabilizatory – statywy, do których stabilnie przytwierdzano śrubami naczynia (kolby lub płytki) z hodowlami komórkowymi. Statywy montowano na platformie wibracyjnej (Beijing Sending Technology, Beijing, Chiny).

Stosowano wibracje o przyspieszeniu = 0,3 g, częstotliwości = 40 Hz i amplitudzie = 50 μm, każdego dnia przez 15 min w ciągu 1, 4, 8 lub 14 dni. Wibracje i indukcja adipogennym medium zachodziły jednocześnie.

Analiza statystyczna wyników

Wyniki przedstawiano jako średnią ± odchylenie standardowe i analizowano stosując jednokierunkową analizę wariancji przy pomocy programu SPSS v17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Za poziom istotności przyjmowano p < 0,05.

Prowadzono 3 niezależne eksperymenty i wszystkie protokoły powtarzano 2 razy.

Wyniki

Wibracje nasilały proces formowania kropelek tłuszczu podczas indukcji adipogennej KMSK

Po 8 dniach hodowli w adipogennym medium komórki barwiono Oil Red O. W grupie kontrolnej komórki zawierające kropelki tłuszczu stanowiły 53,75% wszystkich komórek, natomiast w grupie wibracyjnej były znacznie liczniejsze, stanowiąc 71,43% wszystkich komórek. Jak pokazują autorzy na oryginalnej ryc. 3e oraz w dodatku informacyjnym do publikacji, odchylenia standardowe były niewielkie, a różnica znamienna statystycznie (p < 0,01). Zatem pod wpływem wibracji obserwowano wzrost liczby dojrzałych adipocytów o ok. 18%.

Wibracje powodowały wzrost ekspresji adipogennych genów

Ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że w dniu 1, 4, 8 lub 14 poziom mRNA genów PPARγ oraz C/EBPα wzrastał po wibracjach, wykazując największą wartość w dniu 8 (p < 0,01). Poziom mRNA genu kodującego adiponektynę znacząco wzrastał po wibracjach w dniu 4, 8 lub 14, osiągając największą wartość w dniu 14 (p < 0,01), ale nie prezentując różnic w dniu 1. Największe wzrosty po wibracjach względem grup kontrolnych obserwowano w dniu 8, dla wszystkich 3 badanych genów.

Wibracje wpływały na podniesienie poziomu adipogennego białka PPARγ

Western Blot w dniu 8 ujawnił, że poziom PPARγ znacznie wzrósł po wibracjach z poziomu 0,71 do 1,24 (p < 0,01).

Wibracje aktywowały białko p38

Analiza blotów wykazała, że po dostarczeniu wibracji w dniu 1, 4 lub 8 znacząco (od ok. 2,5- do ok. 3,7-krotnie) wzrósł poziom aktywnej formy białka p38, porównując w danym dniu do grupy kontrolnej (p < 0,01). Podniesienie poziomu fosfo-p38 pod wpływem działania wibracji może implikować aktywowanie przez wibracje szlaku kinaz MAP związanego z białkiem p38.

Aktywowane białko p38 nasilało proces różnicowania KMSK w adipocyty

Zarówno w grupie kontrolnej, jak i wibracyjnej, podanie w dniu 8 inhibitora p38 – SB203580 – obniżało wówczas poziom PPARγ z 55,17% w grupie kontrolnej + DMSO do 45,13% w grupie kontrolnej + inhibitor oraz z 64,48% w grupie wibracyjnej + DMSO do 52,87% w grupie wibracyjnej + inhibitor (p < 0,05).

Również formowanie kropelek tłuszczu zostało obniżone: z 53,75% w grupie kontrolnej + DMSO do 41,99% w grupie kontrolnej + inhibitor i z 71,43% w grupie wibracyjnej + DMSO do 49,83% w grupie wibracyjnej + inhibitor (p < 0,05).

To wszystko wskazuje, ze białko sygnałowe p38 jest pozytywnie zaangażowane w proces adipogenezy KMSK.

Komentarz

W relacjonowanych badaniach wykazano in vitro istotny wpływ wibracji na nasilanie procesu formowania komórek tkanki tłuszczowej z KMSK hodowanych w adipogennym środowisku.

Autorzy badań podkreślają, że zbyt duża zawartość tkanki tłuszczowej w szpiku kostnym może prowadzić do osteoporozy, ponadto podniesiona liczba komórek tłuszczowych może zwiększać ryzyko otyłości, dlatego należy poważnie zrewidować stosowaną w leczeniu tych schorzeń wibroterapię.

Do hodowli komórek macierzystych stosowano tu medium specyficznie indukujące adipogenezę. Wibroterapia^Pro pragnie zauważyć, że może zatem wibracje nie tyle nasilały różnicowanie w adipocyty, ile nasilały sam proces różnicowania, który, gdyby zachodził w innym medium, mógłby kierować los komórek macierzystych na inne ścieżki dojrzewania. Nie badano tutaj markerów osteogenezy i innych spotykanych w szpiku kostnym ścieżek różnicowania, aczkolwiek sami autorzy przywołują wcześniejsze badania, gdzie w warunkach znacznie bliższych naturalnemu środowisku dla KMSK, proces adipogenezy był wręcz przez wibracje hamowany, a z kolei nasilaniu ulegała osteogeneza. Dążenie do poznania reakcji komórek macierzystych hodowanych w medium jednolitym pod względem markerów różnicowania wydaje się jak najbardziej zasadne, by szczegółowo badać molekularne mechanizmy wibroterapii. Ponadto mogłoby generować cenne obserwacje modelowo wskazujące jak prowadzić/ modyfikować wibroterapię w osteoporozie, czy innych schorzeniach związanych z behawiorem komórek macierzystych, szczególnie gdy dochodzi do wyraźnego i jednokierunkowego zaburzenia równowagi na drogach różnicowania. W tym kontekście monitorowanie odpowiednich markerów potencjału różnicującego komórki macierzyste mogłoby stać się standardową praktyką przy stosowaniu wibroterapii.

Ponadto, wg Wibroterapii^Pro, obserwowane tu nasilanie procesu różnicowania komórek macierzystych przez wibracje może sugerować pilną potrzebę zbadania roli wibracji w innych ważnych układach, np. związanych z nowotworzeniem. Często za główną przyczynę ciągłego odnawiania się guza, mimo resekcji, przyjmuje się brak zdolności różnicowania nowotworowych komórek macierzystych (NKM) w komórki dojrzałe, zróżnicowane i przestające się w związku z tym dzielić – mniej wtedy wpływające na złośliwość guza i łatwiej poddające się istniejącym terapiom. Być może wibracje o odpowiednich parametrach, wpływając na nasilenie procesów różnicowania, mogłyby wspomóc istniejące już eksperymentalne terapie próbujące indukować lub odblokowywać procesy różnicowania NKM. Należy jednak pamiętać, że w przypadku NKM mamy do czynienia z bardzo złożonym problemem patologicznym zupełnie nietypowych komórek ulegających w znacznym stopniu różnorakim, w tym przypadkowym, mutacjom i zmianom metabolicznym – trudno zatem o głębszą polemikę bez nowych danych.

Autorzy relacjonowanych badań pokazują ponadto, że indukcja w adipocyty zachodzi najprawdopodobniej przez szlak sygnałowy związany z białkiem p38 i że również wibracje działają właśnie tędy.

Wibroterapia^Pro pragnie zauważyć, że nadal nie tłumaczy to w pełni mechanizmu molekularnego odziaływania wibracji, ciągle brakuje elementów pośrednich. A jeśli wibracje działają przez zwiększanie wchłaniania substancji? W końcu nasilały efekty indukcji adipogennej wywołanej czynnikami obecnymi w medium hodowlanym, wydaje się też, że działały przez ten sam szlak sygnałowy co medium, zatem nie wnosiły nic od siebie, a jedynie nasilały procesy ukierunkowane już czynnikami środowiska. Być może, wpływając na zwiększoną przepuszczalność błon komórkowych dla tych elementów? Badania molekularne w tym kierunku wydają się zatem konieczne – pozytywny wpływ wibracji na zwiększone wchłanianie substancji mógłby być nie do przecenienia w wielu schorzeniach, gdzie stosuje się mniej lub bardziej toksyczne dla organizmu lekarstwa.

Wibroterapia^Pro pozwala sobie na powyższe spekulacje, bo pragnie by odpowiednio wybrzmiał potencjał, jaki niesie za sobą badanie oddziaływania wibracji na poziomie komórkowym i molekularnym, zachęcając, podobnie jak wyniki omawianej publikacji, do stawiania nowych pytań i planowania interesujących eksperymentów.

Więcej w: